Page 81 - Revista de Citricultura Eureka! Noviembre 2023

NO T AS TÉCNIC AS

Identificación de estados inmaduros de pseudocóccidos
mediante qPCR-HRM: aspectos técnicos y moleculares

para su diseño

Claudio Navarro M.*, Diego von Bernath P. y Cristóbal Martínez B.

INBIO Soluciones Biotecnológicas. Santiago, Chile.
*Correspondencia: clnavarro@protonmail.com

Considerando que para el año 2023 se estima que la estrategia de qPCR-TaqMan es muy costosa, debido al uso
exportación de cítricos será de aproximadamente 340.000 de sondas específicas marcadas con agentes fluorescentes
toneladas, la identificación de plagas cuarentenarias en y apantallantes para cada especie a analizar, lo que se
frutas de exportación es relevante dado que su presencia traduce en que cada análisis tiene un alto valor y su acceso
implica el rechazo del lote presentado por el exportador a resulta limitante para algunos productores. Por ello, y en
determinados destinos. Los pseudocóccidos o chanchitos conjunto con el Comité de Cítricos ASOEX, se planteó la idea
blancos son una de las plagas que el SAG busca identificar de generar una estrategia molecular para la identificación
en las inspecciones de fruta para exportación. En el caso de pseudocóccidos usando técnicas moleculares de alta
de la familia Pseudococcidae, sus especies P. viburni, P. precisión, bajo costo y alta reproducibilidad.
calceolariae, P. longispinus, P. cribata y P. meridionalis,
así como Planococcus citri, son de gran relevancia en La técnica de qPCR-HRM (qPCR High Resolution Melting)
el Programa de Pre-Embarque SAG/USDA – APHIS/ corresponde a una variante de los qPCR tradicionales. En
ASOEX. Este programa exige identificar toda especie de esta técnica la amplificación se desarrolla en presencia de un
chanchito encontrada en la inspección de la fruta, de lo fluoróforo de bajo costo que se une al ADN de hebra doble
contrario o si se identifica alguna especie cuarentenaria (P. en condiciones saturantes y que solo emite al estar unido
meridionalis y P. cribata), el lote es rechazado. Actualmente, (ej: SYBR Green, EvaGreen® o LC Green®). Se diseñan dos
la identificación de adultos de estas especies se realiza partidores de PCR que amplifican una zona de alrededor de
de manera taxonómica, sin embargo, para estados 60-250 pb del DNA blanco en todas las especies a identificar.
inmaduros (huevos o ninfas) esta detección se dificulta y La amplificación en cada ciclo produce ADN doble hebra,
para confirmar la especie particular es necesario realizar el cual se satura del fluoróforo, y que una vez terminada la
pruebas moleculares, siendo el PCR cuantitativo (q-PCR) la reacción de PCR se realiza un análisis de curva de fusión de
alternativa más utilizada. Existe un kit de qPCR con sondas alta resolución. Para esto, la placa del termociclador comienza
TaqMan para esta identificación, sin embargo, presenta a aumentar la temperatura de 65 C a 95 ºC en intervalos
o
algunos problemas que pueden dificultar los análisis. Entre de 0,1 a 0,5 ºC dependiendo de la resolución necesaria, lo
estos problemas se cuentan la existencia de resultados que comienza la denaturación del ADN. Este aumento en
no concluyentes, lo que significa que, por el diseño del la temperatura aplicada provoca que la hebra doble pase
kit, no puede identificar la especie a la que corresponde a hebra simple, lo que genera la liberación del fluoróforo,
el huevo encontrado. Adicionalmente, por la naturaleza produciéndose una disminución en la fluorescencia que
de los sistemas qPCR-TaqMan, existe una gran cantidad de el equipo va detectando en cada intervalo. Al existir
ácidos nucleicos (partidores y sondas) combinados en un variabilidad en los distintos amplicones, cada especie
mismo tubo de reacción, lo que genera potencialmente la presentará un patrón de fusión distinto, lo que permite la
producción de productos inespecíficos. Finalmente, esta obtención de curvas representativas para cada insecto. Esta

81
REVISTA DE CITRICULTURA 4(1). 2023.