Page 82 - Revista de Citricultura Eureka! Noviembre 2023

NOTAS TÉCNICAS

técnica ha sido aplicada con éxito para la identificación de
Tabla 1
especies de plantas basado en sus regiones ITS2 (Song et
Pareja de partidores generados sobre las regiones 2 y 3
al., 2016), así como variantes de pseudocóccidos utilizando
(con mayor cantidad de nucleótidos idénticos)
un gen mitocondrial (Wetten et al., 2015). Finalmente,
mediante esta estrategia se han podido identificar la Partidor Secuencia
presencia de variantes de una secuencia que comprende inb_P3 5’ GTTGTACGATCGCGCG 3’
una modificación en apenas una base de un gen particular inb_P4 5’ GACAACGGCCGGAATAACG 3’
de insectos (Klafke et al., 2019).
En la Figura 2, se puede observar un alineamiento de los

Para la identificación de pseudocóccidos presentes en amplificados utilizando como molde DNA genómico de las
Chile usando qPCR-HRM, se debe contar con secuencias seis especies de pseudocóccidos empleando la pareja de
de regiones de alta variabilidad en sus genomas. Debido partidores inbio-P3 e inbio-P4. En efecto, las seis especies
a la alta sensibilidad de la técnica, el primer paso fue de pseudocóccidos presentan bajos porcentajes de
determinar si las secuencias de las regiones de interés identidad en esta región, lo que resulta prometedor para
de las especies de pseudocóccidos presentes en Chile su discriminación por qPCR-HRM.
presentaba alta identidad, de manera de establecer
una secuencia base para cada insecto. Resultó muy Luego de varios pasos de optimización de la concentración de
importante en este punto el aporte del trabajo del grupo partidores, molde, temperaturas de annealing y la cantidad
de la Dra. Zaviezo (Correa et al., 2012), que determinó la de ciclos óptimos para la reacción, se obtuvo un protocolo
secuencia de las regiones COI e ITS2 de 3 de las especies de qPCR-HRM para la discriminación de las seis especies de
de pseudocóccidos presentes en Chile (P. viburni, P. pseudocóccidos usando la pareja de partidores inbio-P3 e
meridionalis y P. citri). Para complementar los resultados inbio-P4, cuyo resultado se observa en la Figura 3. A partir
obtenidos por Correa y colaboradores, la entomóloga de estos análisis, se pudo determinar que la temperatura de
Natalia Olivares, implementó un pie de cría con las seis fusión (Tm) de los amplificados de cada especie corresponde a
o
o
o
especies de pseudocóccidos presentes en Chile, las que P. viburni (85,2 C), P. calceolariae (83,2 C), P. longispinus (85,4 C),
o
o
o
luego de amplificar por PCR su región ITS2, se secuenciaron P. cribata (86,0 C), P. meridionalis (85,6 C) y P. citri (82,8 C). De
y se determinó su correspondencia con las incluidas lo anterior se puede concluir que mediante el uso de la pareja
en la base de datos NCBI. De esta manera, se desarrolló de partidores inbio-P3 e inbio-P4 es posible discriminar las
un alineamiento bioinformático de las secuencias de seis especies de pseudocóccidos presentes en Chile.
la región ITS2 de las seis especies de pseudocóccidos
presentes en Chile (Figura 1). Como se puede observar, El desarrollo de un sistema de detección de pseudocóccidos
en la Figura 1, las distintas especies de pseudocóccidos basado en qPCR-HRM tiene una amplia ventaja comparativa
presentan alta variabilidad en la región ITS2 analizada, respecto al kit utilizado actualmente, la primera es que se
no obstante, en bloques rojos se indican 3 zonas con al disminuye el uso del material para los análisis, desde 12
menos 16 nucleótidos contiguos que presentan un 100 % partidores y seis sondas en el kit qPCR-TaqMan en uso
de identidad entre las seis especies de pseudocóccidos. actualmente, a solo una pareja de partidores en el caso de
El siguiente paso fue la generación de una pareja de qPCR-HRM. Adicionalmente, debido a que la temperatura
partidores, sobre las regiones 2 y 3 (con mayor cantidad de fusión de un amplicón de PCR depende de su secuencia,
de nucleótidos idénticos), los que se identificaron como la presencia de amplificaciones inespecíficas, que suelen
inbio-P3 e inbio-P4, y cuya secuencia se muestra en la ser más pequeñas y con menor (Tm), son fácilmente
Tabla 1. detectables y no interfieren con la identificación de cada

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REVISTA DE CITRICULTURA 4(1). 2023.