Page 115 - Revista de Citricultura Eureka! Noviembre 2021

NOTAS TÉCNICAS

el material genético presente en el tubo para obtener reacción que también pueden generar algún tipo de señal.
hebras simples. Luego, comienzan los ciclos de PCR, Esto se conoce como ruido, y en general se puede notar
que consisten en 35 ciclos de variación térmica (10 en los primeros 15 ciclos de la reacción (Figura 4A). En la
segundos a 95 °C y 45 segundos a 60 °C). En estos ciclos mayoría de los equipos esto se denomina “background”
se separa el ADN a temperatura alta y luego se baja la o “baseline”, y se puede determinar de forma automática
temperatura para promover la hibridación de las sondas o manual, de tal forma que el software pueda realizar los
y partidores (las sondas se diseñan con una temperatura cálculos para sustraer ese nivel basal de fluorescencia en
de hibridación superior para que hibriden primero). De cada pocillo (Heid et al., 1996).
esta forma, solo hibridarán aquellas sondas y partidores
que sean complementarias al material genético presente Por otra parte, para determinar el umbral de amplificación,
(son especie específicas). Durante los 45 segundos que se es necesario tener un parámetro para discriminar donde
mantiene a 60 °C la enzima polimerasa se puede anclar al hubo amplificación. Para esto, se debe indicar un nivel
ADN, gracias a los partidores, y comienza la amplificación umbral de fluorescencia, que en la mayoría de los softwares
del ADN. Como la polimerasa tiene actividad exonucleasa, se llama “threshold”, para poder identificar aquellas
es capaz de hidrolizar cualquier fragmento de ADN que se reacciones en las que se supera esa señal (Figura 4A). El ciclo
encuentre en el proceso. De esta forma se degrada la sonda en el que se sobrepasa este nivel se denomina “Threshold
TaqMan que tiene un doble marcaje molecular (fluoróforo Cycle” o “C ”, y es el valor que se utiliza para determinar
T
y apagador), permitiendo la emisión de fluorescencia que si la reacción fue positiva o no. En general, se consideran
puede ser detectada por el equipo en tiempo real. como positivos todas aquellas reacciones en las que el
C se encuentra entre los ciclos 10 – 30, ciclos inferiores
T
El análisis de los resultados del qPCR-TaqMan es realizado y superiores son descartados, debido a la alta cantidad
en el software correspondiente a cada equipo, los cuales se de ruido y a que con el pasar del tiempo la reacción de
pueden configurar para analizar distintos tipos de ensayos. PCR es cada vez menos específica respectivamente. Este
A diferencia de un PCR convencional en el que el análisis es parámetro también puede ser automatizado o se puede
realizado post PCR con geles de electroforesis, en el qPCR fijar de forma manual, pero lo importante es comprobar
se van realizando mediciones de fluorescencia en cada que la curva de amplificación corte el threshold en la fase
ciclo, lo que permite monitorear el resultado en tiempo exponencial del PCR, puesto que en las fases posteriores la
real y más rápidamente (Heid et al., 1996). La configuración eficiencia de la reacción es menor y los datos son menos
de estos sistemas varía según el fabricante y la química de reproducibles (Heid et al., 1996). El ciclo threshold también
reacción utilizada, sin embargo, existen algunos factores entrega información cualitativa acerca de la cantidad de
que son transversales a todos los ensayos y que deben ser ADN que hay en la muestra, dado que una gran cantidad
considerados al momento del análisis. Lo más importantes de ADN amplifica antes y se obtienen C más bajo, y de
T
es determinar en primer lugar el ruido basal, en segundo manera contraria una muestra con poco ADN entrega un
lugar, el nivel umbral de amplificación, y por último aplicar C más alto.
T
controles positivos adecuados para la validación de la
corrida. Finalmente, se debe verificar el resultado de los controles
utilizados. En el control negativo (sin muestra de ADN) no
Para determinar el ruido basal, se debe considerar no sólo debe haber ninguna amplificación, es decir el C debe ser
T
como las sondas pueden emitir fluorescencia, sino que indeterminado, y el control positivo (con muestra de ADN de
también se deben considerar otros factores, tales como las especies a detectar) siempre debe mostrar amplificación,
los plásticos usados u otros reactivos de la mezcla de la idealmente entre los ciclos 10 – 30. Estos controles entregan

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REVISTA DE CITRICULTURA 2(2). 2021.