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ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA

(5’- CATCGAGAAGAAGTTCGAGAAGAAGG-3’) y EF1986R secuenciación se utilizaron los mismos cebadores directos
(5’ TACTTGAAGGAAGGAACCCTTACC-3’), mientras que y reversos utilizados en la amplificación. En el caso concreto
para el gen de la actina se utilizó el par ACT-512F (5’- de la región ITS también se utilizaron los cebadores
ATGTGCA-AGGCCGGGGTTTCGC-3’) y A C T - internos ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) y LR0R
783R (5’-TACGAGTCCTTCTTCTGGCCCAT-3’) descrito por (5’- GTACCCGCTGAACTTAAGC3’) para la secuenciación
Carbone y Kohn (1999). El cebador V9G (5’-TTACGTCCC- del amplicón. Las secuencias nucleotídicas resultantes
TGCCCTTTGTA- 3’) descrito por De Hoog y van den Ende fueron editadas con el programa UGENE para eliminar las
(1998) y el cebador LR5 (5’- ATCCTGAGGAGGGAAACTTC-3’) regiones de baja calidad y posteriormente se ensamblaron
descrito por Vilgalys y Hester (1990) se utilizaron para [9]. La comparación de las secuencias de nucleótidos y
amplificar la región que va desde el extremo 3’ del aminoácidos (en el caso de los genes EF-1α y ACT) se realizó
gen ribosomal 18S, la primera región intergénica ITS1, con el programa MEGA (Kumar et al., 2018). Las distancias
el gen ribosomal 5S, la segunda región intergénica entre secuencias fueron calculadas como p-distancias
ITS2 y aproximadamente las primeras 900 bases del aplicando el parámetro Complete delection. El alineamiento
gen ribosomal 28S. Las características de los cocteles múltiple se realizó utilizando la herramienta Clustal W
de reacción y las condiciones de PCR se describen en disponible en MEGA (Kumar et al., 2018). La asignación
Bensch, et al. (2012). Los productos de amplificación taxonómica se realizó con la herramienta Blast utilizando
fueron verificados mediante electroforesis en geles de la base de datos nucleotide collection nr/nt (Camacho et al.,
agarosa al 1.2 % (p/v). Posteriormente, los amplicones se 2009).
secuenciaron mediante la metodología de Sanger. Para la

Tabla 2
Secuencias obtenidas para los aislados recuperados de fruta afectada.

Aislado Gen Secuencia amplificada
ACT 5’CGTAAGTCCCAAAACGCCCGCTCTTCTCGCAGCCCGACGGCCAGCTGACAACATCCTAGCTTCCATTGTCGGCAGACCCCGTCACCATGG
GTATGCTCTCCTTGCCCTCCCCACCACCGCCGAATCCAATGTCTAACC-3’
EF-1α 5’TCACTTCTTCGCCCCGCCATGACACCCCGCCTCGTCGCAATCAGCGATAAGGCGACACGGCTTGGCTTGGCGGAGACTTGCTTTCGGTT
GAAGACACCACGCCACCATCATCACCCACCTTGTCCACATCACTGACAACCATCACAG-3’
1
5’ATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAAC
TTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
ITS1-5S-ITS2-28S TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGC
GTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAACCGTCCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGC
GTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGT-3’
5’ATGTGCAAGGCCGGTTTCGCCGGTGACGATGCGCCCAGAGCCGTTTTCCGTAAGTCCCAAAACGCCCGCTTCTCTCGGAGCCCGACGGC
ACT CAGCTGACAACATCCTAGCTTCCATTGTCGGCAGACCCCGTCACCATGGGTATGCTCTCCTTGCCCTCCCCACCACCGCCGAATCCAATGTC
TAACCGCAGCGCAGTATCATGATCGGTATGGGCCAGAAGGACTCGTAATCAATCAATC-3’
5’GTCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTGAGCACTCTCCCGGCAACTCGCTGTCTTTTCATCGCTGCAATCTCTTCTTCGCCCCGCCACGACACC
EF-1α CCGCCTCGTCGCAATCCGCGATAAGGCTACAGTGCTTGGCTTGGCGGAGACTTGCTCNCGACTGATGACAGCACGCCACCATCAACACCC
ACCTTGACCACATCACTGACAGTCATCACAGGAAGCCGCCGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTAA-3’
5’CCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGGCCTTCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCC
AGGGCCGGAAAGTTGGTCAAACCCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTAC
AAGTGACCCCGGCTACGGCCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCC
GGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG
2 CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTG
GTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATC
GTCCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTA
AGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCTCTAGTAA
ITS1-5S-ITS2-28S CGGCGAGTGAAGCAGCAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTCTGAGTGGCCACC
GACCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGCGGTCGGAAAGGCGCTCTATACGTAGCTCCTTCGACGAGTC
GAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGAT
CGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTAAAAGGGAAGGGATTGCAACCAGACTTGCTCGCGGTG
TTCCGCCGGTCTTCTGACCGGTCTACTCGCCGCGTTGCAGGCCAGCATCGTCTGGTGCCGCTGGATAAGACTTGAGGAATGTAGCTCCCTCG
GGAGTGTTATAGCCTCTTGTGATGCAGCGAGCGCCGGGCGAGGTCCGCGCTTCGGCTAGGATGCTGGCGTAATGGTCGTAATCCGCCCGTC
TTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATCTATGCGAGTGTTCGGGTGTCAAACCCCTACGCGTAATGAAAGTGAACGGAGGTGAGAACCG
CAAGGTGCATCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGA
ATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGTATAGGGGCGAA-3’

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REVISTA DE CITRICULTURA 3(2) 2022